熒光定量PCR（qPCR）是一種廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測和基因分型的技術(shù)。羅氏LightCycler® 480是一款常用的熒光定量PCR儀，具有高靈敏度和穩(wěn)定性。以下為詳細(xì)操作步驟，供參考使用。

一、實驗前準(zhǔn)備

1. 儀器檢查

• 確認(rèn)LightCycler® 480主機(jī)、電腦及軟件處于正常工作狀態(tài)。

• 檢查加熱蓋是否清潔，避免污染或殘留物影響實驗結(jié)果。

• 確保電源連接穩(wěn)定，避免實驗過程中斷電。

2. 耗材與試劑準(zhǔn)備

• DNA模板或cDNA

• 引物和探針（如TaqMan探針或SYBR Green染料）

• 聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

• dNTPs

• 緩沖液

• 使用兼容的PCR反應(yīng)板或毛細(xì)管（如96孔板或384孔板）。

• 準(zhǔn)備熒光定量PCR試劑，包括：

• 若使用探針法，需確認(rèn)探針與儀器檢測通道匹配（如FAM、HEX等）。

3. 環(huán)境準(zhǔn)備

• 實驗區(qū)域需清潔，避免氣溶膠污染。

• 建議在超凈臺或通風(fēng)櫥中配制反應(yīng)體系，減少外源DNA污染風(fēng)險。

二、反應(yīng)體系配制

1. 計算反應(yīng)體積

• 根據(jù)樣本數(shù)量和實驗設(shè)計，計算所需試劑總量（通常單反應(yīng)體積為10-20 μL）。

• 預(yù)留額外10%體積以補(bǔ)償移液誤差。

2. 配制主混合液（Master Mix）

• 將除模板外的所有試劑（緩沖液、dNTPs、引物、探針、聚合酶等）混合，渦旋振蕩后短暫離心。

• 分裝至PCR板或毛細(xì)管中，避免產(chǎn)生氣泡。

3. 加入模板

• 在單獨(dú)區(qū)域加入DNA或cDNA模板，避免交叉污染。

• 每孔模板體積需保持一致（如2-5 μL）。

• 設(shè)置陰性對照（無模板對照，NTC）和陽性對照。

4. 密封反應(yīng)板

• 使用光學(xué)密封膜覆蓋反應(yīng)板，確保密封性。

• 若使用毛細(xì)管，需檢查是否閉合。

三、程序設(shè)置與運(yùn)行

1. 啟動軟件

• 打開LightCycler® 480軟件，選擇“New Experiment"創(chuàng)建新實驗。

• 設(shè)置實驗名稱、保存路徑及用戶信息。

2. 編輯程序

• 95℃ 10秒 → 65℃ 60秒 → 95℃連續(xù)升溫（0.1℃/秒）并采集熒光。

• 變性：95℃ 10-30秒

• 退火：50-60℃ 10-30秒（根據(jù)引物Tm值調(diào)整）

• 延伸：72℃ 10-30秒（視產(chǎn)物長度而定）

• 預(yù)變性階段：95℃維持3-10分鐘，激活聚合酶。

• 擴(kuò)增循環(huán)（通常35-45個循環(huán)）：

• 熒光采集：在退火或延伸階段采集信號（根據(jù)染料類型選擇單色或多色檢測）。

• 熔解曲線分析（僅SYBR Green法）：

3. 板布局設(shè)置

• 在軟件中定義樣本位置，標(biāo)注對照孔和待測樣本孔。

• 選擇熒光通道（如FAM對應(yīng)通道1，HEX對應(yīng)通道2）。

4. 運(yùn)行程序

• 將反應(yīng)板放入儀器，確認(rèn)放置平穩(wěn)。

• 點(diǎn)擊“Start"開始運(yùn)行，實時監(jiān)測擴(kuò)增曲線。

四、數(shù)據(jù)分析

1. 基線調(diào)整

• 軟件自動或手動設(shè)置基線范圍（通常為前3-15個循環(huán)）。

• 確保擴(kuò)增曲線在閾值線（Threshold）附近呈現(xiàn)清晰的指數(shù)增長。

2. 閾值設(shè)定

• 手動調(diào)整閾值線至指數(shù)增長期上方，軟件自動計算Ct值（循環(huán)閾值）。

3. 結(jié)果解讀

• 定量分析：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算模板濃度（絕對定量）或比較ΔΔCt值（相對定量）。

• 熔解曲線：SYBR Green法需檢查單峰（特異性擴(kuò)增）或多峰（引物二聚體或污染）。

• 排除異常值（如NTC出現(xiàn)擴(kuò)增提示污染）。

4. 導(dǎo)出數(shù)據(jù)

• 保存實驗文件，導(dǎo)出Ct值、熔解曲線等數(shù)據(jù)。

• 生成報告（PDF或Excel格式）。

五、實驗后處理

1. 儀器維護(hù)

• 關(guān)閉軟件和主機(jī)電源，清潔反應(yīng)槽及加熱蓋。

• 定期進(jìn)行校準(zhǔn)（如光學(xué)校準(zhǔn)或溫度校準(zhǔn)）。

2. 耗材處理

• 廢棄反應(yīng)板按生物危害廢物處理。

• 毛細(xì)管需妥善丟棄，避免劃傷。

3. 數(shù)據(jù)備份

• 將實驗結(jié)果備份至云端或外部存儲設(shè)備。

六、常見問題與解決方案

1. 無擴(kuò)增信號

• 檢查試劑活性（如聚合酶是否失活）。

• 確認(rèn)引物探針設(shè)計正確，模板質(zhì)量合格。

2. 非特異性擴(kuò)增

• 優(yōu)化退火溫度或更換引物。

• 增加模板稀釋度減少抑制物影響。

3. 重復(fù)性差

• 檢查移液精度，確保反應(yīng)體系均一。

• 避免模板降解或污染。

注意事項

• 分區(qū)操作：模板添加與主混合液配制需在不同區(qū)域進(jìn)行。

• 避免頻繁打開反應(yīng)板，防止氣溶膠污染。

• 定期驗證儀器性能，確保數(shù)據(jù)可靠性。

以上為羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，具體參數(shù)需根據(jù)實驗?zāi)康膬?yōu)化。