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賽默飛熒光定量PCR儀注意事項

更新時間:2025-03-18點擊次數(shù):375

賽默飛熒光定量PCR儀(如QuantStudio系列)**時應(yīng)注意的關(guān)鍵事項,涵蓋設(shè)備使用、實驗準備、數(shù)據(jù)分析、安全等方面:


一、實驗準備階段

  1. 樣本與試劑準備

    • 樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融,保持RNA/DNA質(zhì)量。

    • 所有試劑應(yīng)解凍并混勻后再使用。

    • 使用低吸附管或PCR專用耗材,減少吸附損失。

  2. 反應(yīng)體系設(shè)置

    • 嚴格按照試劑說明書配制體系,注意引物、探針濃度。

    • 使用去RNA酶/去DNA酶的無核酸水配制。

    • 配置時操作應(yīng)在冰上進行,避免酶活性變化。

  3. 加樣操作

    • 避免氣泡,影響熒光讀數(shù)。

    • 封板前輕輕離心,確保液體在孔底。

    • 使用光學(xué)封板膜,確保貼合緊密、無褶皺。


二、儀器操作階段

  1. PCR板放置

    • 保持板底清潔,避免灰塵、水漬影響檢測。

    • 板放入儀器前注意方向正確,與軟件板圖一致。

  2. 通道設(shè)定

    • 選擇與試劑染料匹配的熒光通道。

    • 若為多重檢測,確保熒光染料無通道重疊。

  3. 擴增程序設(shè)置

    • 根據(jù)反應(yīng)體系設(shè)定溫度和循環(huán)參數(shù)。

    • 通常熒光采集設(shè)在延伸階段。

  4. 熔解曲線(如SYBR Green)

    • 啟用熔解曲線分析可判斷擴增特異性。

    • 單一峰形代表反應(yīng)特異性良好。


三、數(shù)據(jù)分析階段

  1. Ct值判斷

    • Ct值過高(>35)應(yīng)考慮模板濃度、污染或反應(yīng)效率問題。

    • 無模板對照應(yīng)無擴增曲線,否則懷疑污染。

  2. 擴增曲線觀察

    • 正常擴增曲線呈“S"型。

    • 曲線不規(guī)則或漂移可能因加樣誤差或設(shè)備問題。

  3. 標(biāo)準曲線分析(絕對定量)

    • R2值應(yīng)接近1,擴增效率在90–110%之間較理想。


四、安全與維護

  1. 設(shè)備清潔

    • 加熱模塊表面需定期擦拭。

    • 避免液體流入樣本槽,若有泄漏立即處理。

  2. 避免交叉污染

    • 區(qū)分模板制備區(qū)與擴增區(qū)。

    • 使用過濾吸頭,勤更換手套。

  3. 試劑儲存

    • 酶類試劑儲存于-20℃,避免頻繁凍融。

    • 染料類避光保存,使用后立即蓋緊。

  4. 數(shù)據(jù)備份

    • 定期導(dǎo)出實驗數(shù)據(jù),避免軟件崩潰造成丟失。

    • 軟件升級前應(yīng)先備份方法與結(jié)果文件。


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