實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，結(jié)合熒光探針技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量目標(biāo)DNA或RNA擴(kuò)增過程的分子生物學(xué)儀器。與傳統(tǒng)的PCR不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀能夠在每個(gè)循環(huán)中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，從而準(zhǔn)確地定量目標(biāo)基因的豐度。

一、工作原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過特定的熒光染料或熒光探針來(lái)檢測(cè)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。在PCR反應(yīng)中，隨著DNA鏈的復(fù)制，熒光信號(hào)逐步增強(qiáng)，系統(tǒng)通過測(cè)量每個(gè)循環(huán)中的熒光強(qiáng)度來(lái)跟蹤DNA擴(kuò)增的動(dòng)態(tài)變化。

1. 熒光染料

使用熒光染料，如SYBR Green，當(dāng)染料與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增加。隨著PCR反應(yīng)中DNA產(chǎn)物的逐漸增加，熒光信號(hào)也隨之增強(qiáng)。

2. 熒光探針

另一種方法是使用特定的熒光探針（如TaqMan探針），這些探針特異性地與目標(biāo)序列結(jié)合，當(dāng)探針被降解時(shí)釋放熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)反映目標(biāo)基因的擴(kuò)增情況。

3. 定量分析

通過設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀能夠根據(jù)熒光信號(hào)的變化計(jì)算樣本中目標(biāo)基因的初始拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)精確定量。

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)

1. 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：相較于傳統(tǒng)PCR需要通過電泳等技術(shù)在反應(yīng)結(jié)束后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)實(shí)時(shí)檢測(cè)和記錄熒光信號(hào)，避免了后期處理步驟，節(jié)省時(shí)間和成本。

2. 高靈敏度：該技術(shù)能夠檢測(cè)到低拷貝數(shù)的DNA或RNA，適用于檢測(cè)稀有基因或微量病原體。

3. 定量準(zhǔn)確：實(shí)時(shí)定量PCR儀的定量結(jié)果可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究、病毒載量檢測(cè)和基因分型分析等領(lǐng)域。

4. 高通量分析：現(xiàn)代的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀能夠支持多重通道分析，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)基因，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。

三、應(yīng)用領(lǐng)域

1. 基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR廣泛用于基因表達(dá)研究，能夠定量分析不同組織或細(xì)胞中基因的表達(dá)水平，幫助研究人員了解基因的功能和調(diào)控機(jī)制。

2. 臨床診斷

在臨床上，qPCR用于檢測(cè)病原體的載量，如HIV、HBV、HCV等病毒的定量檢測(cè)。此外，它還可用于檢測(cè)癌癥相關(guān)基因的突變或表達(dá)水平，輔助個(gè)體化治療的基因檢測(cè)。

3. 藥物研發(fā)

在藥物開發(fā)過程中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀用于評(píng)估藥物對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)控作用，檢測(cè)藥物療效，以及進(jìn)行毒理學(xué)研究。

4. 環(huán)境監(jiān)測(cè)

qPCR可用于環(huán)境樣品中的微生物檢測(cè)，如水質(zhì)、土壤或空氣中的細(xì)菌、病毒等生物污染物的定量分析。

四、常見品牌及儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀市場(chǎng)上有多個(gè)型號(hào)，包括Thermo Fisher Scientific（賽默飛）、Bio-Rad、Roche、Agilent等。它們的設(shè)備各有特色，廣泛應(yīng)用于不同的科研和臨床領(lǐng)域。

五、總結(jié)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是一種高度敏感、準(zhǔn)確和多功能的分子生物學(xué)工具，已成為現(xiàn)代基因研究和臨床檢測(cè)中的核心設(shè)備。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，qPCR儀器將繼續(xù)在醫(yī)學(xué)、制藥、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。